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蛋白质化学

氨基酸

蛋白质氨基酸的结构及分类

蛋白质的水解

根据水解程度的不同，可分为完全水解（得到的水解物是氨基酸的混合物）和部分水解（得到的产物是各种大小的肽段和氨基酸）

水解方法有酶水解、酸水解和碱水解（使部分氨基酸结构发生变化）

蛋白质氨基酸和非蛋白氨基酸

参与组成蛋白质的氨基酸仅有20种，且均属L-氨基酸（甘氨酸除外），称为蛋白质氨基酸

结构及分类

结构

除脯氨酸和氢脯氨酸外，这些天然氨基酸在结构上的共同特点为：A.都具有旋光性 B.都具有D-型和L-型两种立体异构体。目前已知的天然蛋白质中氨基酸都为L-型。

分类

根据R基的性质分类

非极性氨基酸（疏水氨基酸） Ala/Val/Leu/Ile/Pro/Phe/Trp/Met/ 丙缬亮异亮脯苯丙色

极性氨基酸（亲水氨基酸）酸性氨基酸：Asp/Glu 天冬谷碱性氨基酸： Lys/Arg/His赖精组非解离性的极性氨基酸：Gly/Ser/Thr/Cys/Tyr/Asn/Gln 甘丝苏半胱酪天冬酰胺谷氨酰胺

根据R基的结构分类芳香族氨基酸：Phe/Tyr 杂环氨基酸：Trp/His/Pro，其他均为脂肪族氨基酸

按氨基酸能否在人体内合成必需氨基酸：Lys/Trp/Met/Phe/Val/Leu/Ile/Thr 赖色甲硫苯丙缬异亮苏半必需氨基酸：Arg/His 精组其他均为非必需氨基酸

非蛋白质氨基酸胶原蛋白中含有羟基脯氨酸和5-羟基赖氨酸，弹性蛋白中含锁链素和异锁链素，肌肉蛋白中存在甲基组氨酸，ε-N-甲基氨酸，和 ε-N-三甲基赖氨酸

氨基酸的理化性质

物理性质氨基酸在可见光范围内均无光吸收，在远紫外区均有光吸收；在近紫外区含苯环氨基酸有光的吸收，蛋白质一般最大光吸收在280nm波长处，可用紫外分光光度法测蛋白质含量，一般都溶于水，不溶于丙酮，均为白色结晶或粉末

两性解离与等电点

氨基酸可接受氢离子又可电离出氢离子，所以它具有酸碱两性物质，通常情况下以两性离子的形式存在

氨基酸在酸性环境中，主要以阳离子的形式存在，在碱性环境中，主要以阴离子的形式存在，在某一pH环境下，以两性离子的形式存在，该pH称为该氨基酸的等电点

氨基酸的等电点：在某一pH的溶液中，氨基酸解离成阳离子和阴离子的趋势和程度相等，成为兼性离子，呈电中性，在电场中既不向阳极移动也不向阴极移动。此时溶液的pH值称为该氨基酸的等电点，在等电点处，氨基酸溶解度最小

重要化学反应

1）与茚三酮反应用于氨基酸的定性定量分析生成一种蓝紫色化合物，在不同条件下与两种亚氨酸（脯氨酸和氢脯氨酸）反应生成的产物呈黄色或红色

2）与2,4-二硝基氟苯反应（Sanger反应）弱碱条件下反应，用于测定肽链N末端氨基酸，生成黄色的二硝基苯丙氨酸

3）与异硫氢酸苯酯反应（Edman反应）用于氨基酸序列分析，并据此设计了蛋白质测序仪。从N段依次测定

肽

肽和肽链的结构和命名

多肽链中的氨基酸，由于其部分基团参与了肽键的形成，剩余的结构部分则称为氨基酸残基，氨基酸残基的估算方法：蛋白质分子量/110，多肽化合物的名称，通常按照肽内氨基酸残基的排列顺序，以残基名称（如某某氨酰）从N端依次阅读到C端，并以C端残基全名结束肽的名称。

肽的理化性质

旋光性、两性解离与等电点与氨基酸类似，双缩脲反应：含有两个或两个以上肽键的化合物与碱性硫酸铜作用，生成蓝紫色的复合物，肽键越多颜色越深，受蛋白质特异性影响小，可用于肽和蛋白质定量测定及测定蛋白质水解程度

几种天然寡肽

谷胱甘肽（在体内参与氧化还原过程，作为某些氧化还原酶的辅酶，保护巯基，或防止过氧化物积累。抗氧化）、抗生素类多肽（短杆菌肽S、抗菌）、α-鹅膏蕈碱（结合RNA聚合酶II）、促肾上腺皮质激素（ACTH）39肽、神经递质：内啡肽、脑啡肽（镇痛）

蛋白质的分子结构

一级结构

蛋白质一级结构的内涵

蛋白质的一级结构是指蛋白质中的氨基酸从N末端到C末端的排列顺序，又叫氨基酸序列，包括氨基酸顺序、肽链数目、二硫键数目及其位置

蛋白质一级结构是蛋白质空间构象和特异生物学功能的基础一级结构决定高级结构，高级结构决定功能

氨基酸序列的测定

分析已纯化蛋白质的氨基酸组成--测定多肽链的氨基末端与羧基末端为何种氨基酸残基--把肽链水解成片段，分别进行分析--测定各肽段的氨基酸排列顺序，一般用Edman降解法--一般需用数种水解法，并分析出各肽段中的氨基酸顺序，然后经过组合排列对比，最终得出完整肽链中氨基酸的顺序结果

通过核酸来推演蛋白质中的氨基酸序列分离编码蛋白质的序列--测定DNA序列--排列出mRNA序列--按照三联密码的原则推演出氨基酸的序列

维持蛋白质结构的作用力

维持蛋白质结构的作用力有氢键、范德华力、疏水作用、盐键、二硫键和配位键维持蛋白质一级结构的主要作用力为肽键（共价键）还有二硫键

二级结构

内涵

蛋白质的二级结构是肽链主链不同肽段通过自身的相互作用、形成氢键，沿某一主轴盘旋折叠而形成的局部空间结构。氢键是稳定二级结构的主要作用力。

包括

α-螺旋

结构要点：1）单链，主链可向左旋或右旋 2）每一圈含有3.6个氨基酸残基，螺距0.54nm 3）自N端起每个氨基酸残基的羰基氧与前面第三个氨基酸残基的氨基氮形成氢键，且氢键与主轴平行

有些结构不易形成α-螺旋：1）Gly和Pro不易形成α-螺旋：甘氨酸（Gly）的R基为H，空间占位很小，也会影响该处螺旋的稳定，脯氨酸（Pro）其α-碳原子位于五元环上，不易扭转，加之它是亚氨基酸，不易形成氢键，故不易形成上述α-螺旋 2）多聚大侧链AA 3）多聚相同电荷AA

β-折叠

结构要点：1）β-折叠结构几乎所有肽键都参与链间氢键的形成，氢键与链的长轴接近垂直 2）多肽链呈锯齿状（或扇面状）排列成比较伸展的结构 3）相邻两个氨基酸残基的轴心距离为0.35nm，侧链R基团交替地分布在片层平面的上下方，片层间有氢键相连 4）有平行式和反平行式两种，反平行式更稳定 5）这种片层在丝心蛋白里大量存在

β-转角

肽链主链出现的180度回折部分这种转折的要领是多肽链中残基n的-CO基于残基（n+3）的-NH基形成氢键

无规卷曲

指没有一定规律的松散肽链结构

偏好性蛋白质二级结构是以一级结构为基础的，一段肽链其氨基酸残基的侧链适合形成α-螺旋或β-折叠，它就会出现相应的二级结构

测定方法

1）重氢交换法：测定α-螺旋含量 2）核磁共振法：测定具体氨基酸残基的构象变化 3)圆二色性法：测定α-螺旋和β-折叠的含量

蛋白质的超二级结构和结构域

超二级结构

超二级结构是指多肽链上若干相邻的构象单元，（如α-螺旋、β-折叠、β-转角等0彼此作用，进一步组合成有规则的结构组合体，作为三级结构的构件，如α-α-α，β-β-β，β-α-β等

部分已知功能的超二级结构：锌指结构：识别特定碱基序列的一种普遍性的转录因子结构、亮氨酸拉链

结构域

结构域是存在于球状蛋白质分子中的两个或多个相对独立、在空间上能辨认的三维实体

结构域通常是几个超二级结构的组合，结构域之间常形成裂隙，比较松散，往往是蛋白质优先被水解的部位。酶的活性中心往往位于两个结构域的界面上。结构域之间由铰链区相连，使分子构象有一定的柔性，通过结构域之间的相对运动，使蛋白质分子实现一定的生物功能

三级结构

整条肽链中全部氨基酸残基的相对空间位置，即肽链中所有原子在三维空间的排布位置维系三级结构的化学键：氢键、疏水键、盐键和范德华力等次级键以及二硫键X射线衍射法（蛋白质晶体）和核磁共振技术（小分子蛋白质）是研究蛋白质三维空间结构最准确的方法，冷冻电镜近年大热

四级结构

蛋白质四级结构指由两个或两个以上具有三级结构的多肽链按一定方式聚合而成的特定构象的蛋白质分子，其中每条多肽链称为亚基。通常亚基只有一条多肽链，但有的亚基由两条或多条多肽链组成，这些多肽链间多以二硫键相连。亚基单独存在时无生物学活性。一般来说具有四级结构的蛋白属于寡聚蛋白

在蛋白质四级结构中，亚基之间的作用力主要包括：氢键、离子键、范德华力和疏水键。即亚基之间主要是通过次级键彼此缔合在一起。疏水键是最主要的作用力。

蛋白质结构与功能的关系

一级结构与功能的关系（镰刀型细胞贫血症）

一级结构的种属差异与分子进化不变残基：同源蛋白的一级结构中有许多位置的氨基酸，它们在进化上比较稳定，对所有种属来说都是相同的可变残基：不变残基外的残基。不同种属的可变残基有很大变化。

一级结构的变异和分子病由于基因突变导致蛋白质一级结构发生变化，使蛋白质的生物学功能减退或丧失，甚至造成生理功能的变化而引起的疾病，称为分子病，如镰刀型细胞贫血症。

一级结构决定高级结构：1960年Anfinsen的核糖核酸酶去折叠和重折叠实验说明问题：A.蛋白质的变性是可逆的，变性蛋白质在一定条件下可以恢复活性B.恢复的原因是在一定条件下可自身折叠成天然构象C.前两项根源是蛋白质之所以能形成复杂的三级结构，所需要的全部信息都包含在一级结构中D.一级结构决定它的高级结构

空间结构与功能的关系（肌红蛋白和血红蛋白）

别构效应：一个寡聚体蛋白质的一个亚基与其配体结合后，能影响此寡聚体中另一个亚基与其配体结合能力的现象，称为协同效应。如果是促进作用则称为正协同效应，如果是抑制作用则称为负协同效应。

蛋白质的重要性质

蛋白质的相对分子量

沉降速度法一种蛋白质在单位离心场里的沉降速度为恒定值，称为沉降系数，常用s表示，许多蛋白的s值都在1*10（-13）到200*10（-13）之间，因此采用1*10（-13）作为沉降系数的单位，用S表示。

凝胶过滤法该法仅适用于球状分子的相对质量测定

SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法 SDS与蛋白质分子的结合，掩盖了蛋白质原有电荷和形状的差异；相对迁移率：蛋白质分子的移动距离与前沿物质移动距离的比值，称为相对迁移率。

蛋白质的两性解离及等电点

当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正负离子的趋势相等，即成为兼性离子，静电荷为零，此时溶液的pH称为蛋白质的等电点，处于等电点的蛋白质溶解度最低，可用于蛋白质的分离

在不含任何盐的纯水中进行等电点测定。此时测得的等电点称为等离子点，是蛋白质的特征常数。盐的存在常导致蛋白质的等电点发生明显的改变，这可能是因为蛋白质中的某些解离基团与盐中相应的离子等结合

电泳（通过蛋白质在电场中永东而达到分离各种蛋白质的技术）

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳常用于蛋白质分子量的测定

等电聚焦电泳通过蛋白质等电点的差异而分离蛋白质的电泳方法

双向凝胶电泳蛋白质组学研究的重要内容

蛋白质的胶体性质

蛋白质胶体稳定的因素：颗粒表面电荷、水化膜由于胶体溶液中的蛋白质不能透过半透膜，因此可以应用透析法将非蛋白的小分子杂质除去。透析法：以半透膜提纯蛋白质的方法

蛋白质的沉淀反应

蛋白质在溶液中靠水化膜和电荷保持其稳定性，水化膜和电荷一旦除去，蛋白质溶液的稳定性就被破坏，蛋白质就会从溶液中沉淀下来，此现象即为蛋白质的沉淀作用

可逆沉淀

在温和条件下，通过改变溶液的pH或电荷状况，使蛋白质从胶体溶液中沉淀分离。在沉淀过程中，结构和性质都没有发生变化，在适当的条件下，可以重新溶解形成溶液，所以这种沉淀又称为非变性沉淀

可逆沉淀是分离和纯化蛋白质的基本方法，如等电点沉淀法、盐析法和有机溶剂沉淀法等。

不可逆沉淀

在强烈沉淀条件下，不仅破坏了蛋白质胶体溶液的稳定性，而且也破坏了蛋白质的结构和性质，产生的蛋白质沉淀不可能再重新溶解于水。由于沉淀过程发生了蛋白质的结构和性质的变化，所以又称为变性沉淀。

如加热沉淀（次级键）、强酸强碱沉淀（影响电荷）、重金属盐沉淀（汞离子、铅离子、铜离子等）和生物碱试剂或某些酸类沉淀等都属于不可逆沉淀

蛋白质的变性和复性

变性定义

当变性蛋白质受到某些物理因素或化学因素的影响，使其分子内部原有的高级结构发生变化时，蛋白质的理化性质和生物学功能都随之改变或丧失，但并未导致蛋白质一级结构的变化，这种现象称为变性作用变性本质：分子中各种次级键断裂，使其空间构象从紧密有序的状态变成松散无序的状态，一级结构不被破坏。

引起变性的主要因素

物理因素：加热、高压、紫外线照射、X-射线、超声波、剧烈振荡和搅拌等化学因素：强酸强碱、脲、去污剂（SDS）、重金属盐、三氯醋酸、浓乙醇等

变性后的表现

1）生物活性丧失 2）溶解度降低，对于球状蛋白粘度增加 3）光吸收系数增大 4）生物化学性质改变 5）组分和分子量不变

蛋白质的复性

如果引起变性的因素比较温和，蛋白质构象仅仅是有些松散时，当除去变性因素后可根据热力学原理缓慢地重新自发折叠恢复原来的构象，这种现象称作复

蛋白质的紫外吸收与呈色反应

蛋白质的紫外吸收

蛋白质在远紫外线区有较大的吸收，在280nm处有一特征吸收峰，可根据这一特性对蛋白质进行定性定量鉴定测定范围：0.1~0.5mg/ml

蛋白质的呈色反应（一般反应：指游离氨基酸也具备的反应，如米伦反应、酚试剂反应等特殊颜色反应：指蛋白质有而氨基酸不具备的呈色反应，如蛋白质的双缩脲反应）

双缩脲反应形成紫红色化合物，一切蛋白质或二肽以上的多肽都有双缩脲反应，但有双缩脲反应的物质不一定都是蛋白质或多肽

茚三酮反应除脯氨酸、羟脯氨酸和茚三酮反应产生黄色物质外，所有α-氨基酸及一切蛋白质都能和茚三酮反应形成蓝紫色物质。β-丙氨酸、氨和许多一级胺都呈正反应。故与茚三酮呈阳性反应的不一定是氨基酸或蛋白质，所以在定性定量测定时，因严禁干扰物的存在。

黄色反应多数蛋白质分子含有带苯环的氨基酸，所以有黄色反应，苯丙氨酸不易硝化，需加入少量浓硫酸才有黄色反应

考马斯亮蓝反应在酸性溶液中，以游离态存在呈棕红色；当它与蛋白质通过疏水作用结合后变为蓝色。常用于测定蛋白质含量，灵敏度高、反应速度快

蛋白质分类及分离提纯和应用

蛋白质分类

按组成成分

简单蛋白质：不含有非蛋白质组分，水解后的最终产物只有氨基酸单纯蛋白质按其溶解性有可分为：白蛋白、球蛋白、谷蛋白、醇溶谷蛋白、精蛋白、组蛋白以及硬蛋白等

结合蛋白质：结合蛋白是指由简单蛋白和非蛋白组分结合而成的蛋白质按辅基的不同，又可分为：糖蛋白、脂蛋白、色蛋白、核蛋白、磷蛋白、金属蛋白等

按分子的形状或空间构象

纤维状蛋白质：分子很不对称，形状类似纤维，一般不溶于水。典型的有：胶原蛋白质、弹性蛋白质、角蛋白质、丝蛋白质等

球状蛋白质：分子的形状接近球形，空间构象比纤维状蛋白复杂。球状蛋白质的溶解性较好，能结晶，生物体内的蛋白质大多属于这一类。典型的有：胞质酶类等

分离提纯及应用

分离提纯

1）前处理：将组织破碎，使蛋白质从细胞中破碎出来 2）粗分级：通常用盐析、等电点沉淀、超滤、有机溶剂分级等简便、处理量大的方法从蛋白质混合液中除去大量杂质，得到浓缩蛋白质溶液 3）细分级；选用分辨率高的方法进一步提纯，如经过凝胶过滤、吸附层析、离子交换层析、反相高效液相层析、亲和层析以及凝胶电泳、等电聚焦等

应用

蛋白质制剂主要用于某些疾病的预防治疗和辅助诊断，某些蛋白质已用于食品加工和饲料工业

蛋白质化学

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